Методологія генної інженерії бере початок у 70-х роках ХХ сторіччя. Мета методів – внесення в організм не характерного для нього гену. Останній синтезують заново або переносять з іншого організму. Таким чином бактеріальна клітина може перетворюється на машину по виробництву необхідної нам сполуки. Як приклад можна розглянути перенос до клітини бактерій генів, що кодують інсулін людини, гормон росту людини та бичачий соматотропін.
Для отримання гену в наш час достатньо лише однієї вихідної копії. Отримання множинних ідентичних копій має назву клонування. Як клонуючий вектор, що переносить ДНК, яку необхідно клонувати, використовуються бактеріальні фаги чи плазміди (невеличкі фрагменти кільцевої бактеріальної ДНК, що мають незалежну реплікацію від основної дезоксирибонуклеїнової кислоти). Бактеріофаги – віруси, що здатні вводити власну ДНК до бактеріальної клітини, де ця нуклеїнова кислота реплікується. Призначені для клонування ділянки поєднуються або з плазмідною, або ж з фаговою ДНК. Отримана «конструкція» - рекомбінантна ДНК. При введенні такої ДНК до клітини бактерії кількість її копій буде збільшуватися з кожним циклом ділення. Таким чином сторонній для бактеріальної клітини ген може використовуватися для отримання в промислових кількостях корисних білків.
Вбудова нових генів в ембріони рослин та тварин з метою створення трансгенних організмів, які можуть передавати ці гени нащадками, є більш складною задачею.
Генну інженерію бактерій поділяють на 5 стадій:
1. 1, Отримання копії необхідного гена.
2. 2, Його вбудовування у вектор.
3. 3, Використання вектору з метою введення необхідного гену до клітини-реципієнта.
4. 4, Селекція бактерій з чужорідною (донорною) ДНК.
5. 5, Клонування гену.
В деяких випадках можуть бути присутніми додаткові етапи.
Отримання копії необхідного гена.
Для цього застосовують три методи: за допомогою зворотної транскриптази отримують на матриці мРНК копію гену; синтезують штучний ген; використовують метод «дробовика», за якого ДНК розрізається рестриктазами і виділяється фрагмент з необхідним геном.
Вбудова генів у вектор.
З бактеріальних клітин виділяють плазміди, що очищуються і оброблюються рестриктазами, котрі використовуються на першій стадії для добування гену. Після змішування виділеного гену з обробленими рестриктазою плазмідами відбувається поєднання їх за липкими кінцями. Спочатку зв’язування відбувається за рахунок водневих зв’язків, а після додавання ДНК-лігази утворюються фосфодиестерні зв’язки.
При вбудовуванні генів у вектор часто використовують фаговий вектор. Фаги дозволяють клонувати більші фрагменти ДНК у порівнянні з тими, що переносяться за допомогою плазмід. Зчаста для цього використовується фаг λ. Ділянка ДНК бактеріофага замінюється на ту, що необхідно клонувати.
Введення векторів до клітини-хазяїна.
На цьому етапі плазмідний чи фаговий вектор вводиться до бактеріальної клітини. Частіше за все це Кишкова паличка, оскільки її геном добре вивчений і вона швидко росте. Існує навіть спеціальний лабораторний мутант цієї бактерії, що не здатний заразити людину.
При введенні плазмідного вектору клітину бактерії піддають термічному шоку у присутності йонів Кальцію, що призводить до утворення пор в клітинній мембрані. Через них вектор потрапляє до клітини. Фагові вектори вводяться шляхом інфікування клітин. Введення ДНК в бактеріальну клітину називають трансформацією.
Відбір трансформованих клітин.
При змішування плазмідних векторів з ДНК можуть утворитися клітини, що не отримали плазміди. Або такі, що отримали їх, але без донорської ДНК. Щоб відсортувати такі клітини, за основу беруть плазміди стійкості до певних антибіотиків або такі, що кодують певний фермент (β-галактозидазу), який розщеплює лактозу. Достатньо лише виростити бактерії у присутності антибіотику та лактози.
Потрібні бактерії також відбирають за допомогою зондів. Їх використовують в разі, коли відома повна або часткова послідовність ДНК, яку потрібно знайти. В якості зондів використовують короткі фрагменти ДНК або РНК, які зв’язуються з ділянкою потрібного гена, тобто є комплементарними їй. Зазвичай зонди виготовляють з нуклеотидів, мічених радіоактивним Фосфором, який виявляють радіоавтографією.
